Mgr Roksana Wałęsa



Promotor: dr hab. Małgorzata Broda, prof. UO

Analiza konformacyjna N-metylowanych peptydów. Studia teoretyczne i eksperymentalne.

Słowa kluczowe: peptydy, N-metylowanie, analiza konformacyjna, metody DFT, błony liposomowe

Cele projektu

Zamierzeniem badawczym tego projektu jest metodyczne zbadanie, zarówno metodami eksperymentalnymi (spektroskopia FTIR, EPR, NMR, ramanowska, dyfraktometria) jak i przy pomocy obliczeń teoretycznych właściwości modelowych
N-metylowanych peptydów, w tym natury ich oddziaływań z błonami lipidowymi.

Zastąpienie amidowego atomu wodoru grupą metylową (rys.1) jest jedną
z najstarszych stosowanych modyfikacji peptydów. [Zhang 2006].

Rys. 1. Drugo- i trzeciorzędowe ugrupowanie amidowe.


Przyjmuje się, na podstawie wielu badań teoretycznych i eksperymentalnych, że
N-metylowane peptydy stanowią potencjalne inhibitory tworzenia się płytek amyloidowych, co ma istotne znaczenie w leczeniu chorób degeneracyjnych: choroby Alzheimera, genetycznych chorób prionowych, parkinsonizmu oraz cukrzycy typu II [Matsubara 2002, Kokkoni 2006].

Właściwości N-metylowanych peptydów wynikają z ich unikatowych cech konformacyjnych. Wprowadzenie grupy metylowej do łańcucha peptydowego zwiększa lipofilowość peptydu, co automatycznie podnosi biodostępność tego typu związków oraz ułatwia przenikanie przez błony biologiczne. Obecność trzeciorzędowego ugrupowania amidowego powoduje, że spada preferencja trans ugrupowania peptydowego na korzyść konfiguracji cis, co oznacza, że w modyfikowanych peptydach może dochodzić do znaczącej zmiany konformacji w porównaniu do wyjściowego analogu [Laufer 2010]. Zastąpienie atomu wodoru przy amidowym atomie azotu grupą metylową zaburza tendencję do tworzenia wiązań wodorowych, a co za tym idzie organizację struktur drugo- i trzeciorzędowych białek.

Jedną z najważniejszych konsekwencji wprowadzenia grupy metylowej do ugrupowania peptydowego jest wzrost odporności peptydu na degradację proteolityczną. Zatłoczenie steryczne utrudnia dostęp endopeptydaz (enzymów trawiących peptydy/białka) do grupy amidowej. Ta właściwość N-metylowanych peptydów znajduje duże zainteresowanie w przemyśle farmaceutycznym w celu zwiększenia stabilności in vivo leków peptydowych, a poprzez wyraźną zmianę konformacji wzrost powinowactwa leku do receptora, przedłużenie czasu działania oraz łatwiejszą przenikalność przez błony biologiczne [Chatterjee 2008].


Planowane metody i narzędzia badawcze

W ramach niniejszego projektu planowane są badania właściwości konformacyjnych
i spektroskopowych modelowych N-metylowanych peptydów oraz poznanie wpływu tego typu związków na dynamiczne i strukturalne właściwości modelowych błon lipidowych. Badania prowadzone będą wieloaspektowo, metodami teoretycznymi i eksperymentalnymi, co umożliwi porównanie konformacji badanych peptydów w stanie krystalicznym, roztworze czy błonie liposomowej z konformacjami uzyskanymi na drodze modelowania w fazie gazowej oraz w otoczeniu rozpuszczalnika.

Analiza konformacyjna badanych peptydów metodami obliczeniowymi przeprowadzona zostanie za pomocą metod DFT. Badania teoretyczne prowadzone będą z wykorzystaniem mocy obliczeniowej Wrocławskiego Centrum Sieciowo – Superkomputerowego (WCSS) oraz Akademickiego Centrum Komputerowego CYFRONET AGH.

Metodami instrumentalnymi, które zostaną wykorzystane w projekcie są NMR, EPR, FT-IR, spektroskopia Ramana, dyfraktometria rentgenowska oraz metody elektryczne
w testowaniu błon modelowych – impregnowanych filtrów. Planowana jest synteza
N-metylowanych pochodnych peptydów. Zsyntezowane związki poddane zostaną analizie rentgenowskiej, co pozwoli na określenie konformacji uzyskanych peptydów w krysztale. Planowana jest również pełna analiza spektroskopowa badanych związków. Określenie właściwości konformacyjnych N-metylowanych peptydów w roztworze możliwe będzie poprzez analizę widm NMR, FT-IR i widm Ramana. W niniejszym projekcie planujemy również wykonać pomiary NMR w fazie ciekłej w celu wyznaczenia wpływu N-metylowanych peptydów na krytyczne stężenie micelarne (CMC) modelowych błon biologicznych. Ponadto planujemy wykonanie widm i pomiar czasów relaksacji dla poszczególnych fragmentów łańcucha hydrofobowego lipidu w celu oszacowania sposobu penetracji błony przez badane związki oraz rozpuszczalnik (D2O). Umożliwi to oszacowanie ich wpływu na przepuszczalność i płynność badanych błon biologicznych.

Wpływ realizacji projektu na wzrost innowacyjności gospodarki regionu poprzez zintensyfikowanie powiązań między nauką i przemysłem, w tym określenie możliwości zastosowania wyników badań w konkretnym sektorze bądź przedsiębiorstwie

Ponadto efektem realizacji projektu będzie praca doktorska, publikacje naukowe i wystąpienia na konferencjach naukowych. W ramach pracy doktorskiej planowane jest poznanie właściwości strukturalnych N-metylowanych peptydów, co pozwoli na bardziej efektywne modyfikowanie struktur aktywnych biologicznie molekuł poprzez wprowadzanie bądź usuwanie podstawników metylowych w różnych miejscach modelowych peptydów. Możliwe jest również szacowanie aktywności zmodyfikowanego związku. N-metylowane peptydy należą do jednych z bardziej obiecujących związków ze względu na ich podwyższoną lipofilowość gwarantowaną obecnością grupy metylowej przy wiązaniu amidowym, a co za tym idzie są one lepiej przyswajalne i łatwiej przenikają przez błony biologiczne, co polepsza ich właściwości farmakokinetyczne. Dlatego np. N-metylowane peptydy należą do jednych z najbardziej obiecujących inhibitorów agregacji płytek amyloidowych. Zahamowanie tego procesu może okazać się skutecznym podejściem
w profilaktyce i leczeniu objawowym choroby Alzheimera.

Ze względu na wzrastające użycie środków ochrony roślin, nasze środowisko staje się coraz bardziej zanieczyszczone przez różnego rodzaju związki szkodliwe dla ludzi i zwierząt, w tym również peptydowe antybiotyki. Opolszczyzna jest dobrze rozwiniętym terenem rolniczym, a możliwość przedostawania się szkodliwych substancji do produktów roślinnych i zwierzęcych stanowi realne zagrożenie. Znajomość właściwości potencjalnie szkodliwych N-metylopeptydów prowadzi do opracowania skutecznych metod ich selektywnej degradacji.


Literatura


  1. Kokkoni N., Stott K., Amijee H., Mason J.M., Doig A.J., Biochemistry, 2006, 45, 9906-9918.

  2. Zhang S., Prabpai S., Kongsaeree P., Arvidsson P.I., Chem. Commun., 2006, 497–499.

  3. Laufer B., Frank A.O., Chatterjee J., Neubauer T., Mas-Moruno C., Kummerlöwe G., Kessler H., Chem. Eur. J. 2010, 16, 5385 – 5390.

  4. Matsubara KAoyama KSuno MAwaya T., Neurotoxicol Teratol., 2002, 24(5), 593-8.

  5. Chatterjee J., Gilon CH., Hoffman A., Kessler H., Acc. Chem. Res., 2008, 41(10), 1331-1342.





dol